Protocolo para Sequenciamento de DNA

Antes de iniciar qualquer experimento lembre-se de verificar se tem todos os reagentes, equipamentos, ou seja, todos os materiais necessários!

1. Purificação de DNA de solução

Kit: GFX  PCR  DNA and gel band purification kit

Código: 27.9602.01

Marca: GE Healthcare

Lote:

Validade:

  

Seguir Protocolo do kit

** volume máximo de produto de PCR é de 100µL

1.      acoplar a coluna de GFX em tubo que acompanha o kit. Utilizar 1 coluna para cada amostra.

2.      identificar tubo e a coluna

3.      add-se 500 µL  de Capture Buffer na coluna GFX (se o seu produto de PCR tem 100µL, caso contrário fazer a regra de 3).

4.      em seguida, adiciona-se 100 µL do produto de PCR e homogeniza-se de 4 a 6 vezes com a própria ponteira, tomando cuidado para a ponteira não tocar nas fibras da coluna.

5.      centrifugar 30 segundos em rotação máxima

6.      desprezar a solução decantada e recolocar a coluna no tubo

7.      add-se 500 µL de Wash buffer (WB) previamente diluído em etanol absoluto (* preparar antes ao uso)

Exemplo: Para 10 amostras deve preparar 5000µL de WB de trabalho.

Porque:  10 amostras x 500 µL WB  = 5000 µL.

Como preparar: 1000 µL WB conc + 4000 µL de etanol absoluto = 5000 µL WB

                       

* Se o kit for consumido dentro de 30 dias, pode preparar todo Washer Buffer com etanol conforme a bula, caso contrário é melhor preparar na hora do uso. Por isso a identificação na tampa do frasco é importante (etanol: sim ou não)

8.      centrifugar 30 segundos, rotação máximas

9.      transferir a coluna GFX para tubo eppendorf  estéril, livre de DNase e RNase e com tampa, devidamente identifico.

10.  aplicar 50µL de buffer eluição ou água ultra pura autoclavado, no centro da fibra de vidro da coluna sem tocar a ponteira na fibra.

11.  incubar a temperatura ambiente por 1 minuto

12.  centrifugar 1 minuto a alta rotação

13.  armazenar o produto purificado em freezer -20ºC.

2. Quantificação do DNA purificado em gel

1. preparar o gel de agarose 1,5 a 2,0%
2. preparar amostra

- misturar 4µL de produto purificado + 1µL de azul de bromofenol

3. preparar marcador (low mass ladder – Invitrogen)

- misturar 4µL de low mass ladder + 1µL de azul de bromofenol

4. aplicar 5 µL de  amostra e marcador
5. aguardar  corrida
6. fazer  leitura no transluminador seguindo o protocolo do low mass ladder
7. registrar  concentração.

3. Reação para Sequenciamento

Kit: Big Dye V 3.1

Código:

Marca: Applied Biosystems

Lot:

Validade:

A) Reação

Preparar na cuba de gelo

Reagente	concentração	Quantidade por amostra
Buffer 5X	1X	4,0 µL
Pirmer F ou R	3,3 pmol/µL	1,0 µL
Produto de PCR purif.	30 ng (+ ou -)	2 µL
Big Dye		1,5 µL
H2O		11,5 µL
Total		20µL

Após adicionar Big-Dye, trabalhar sempre protegido da luz (envolver a placa em papel alumínio)

B) Condição para amplificação

Termociclador: Eppendorf  Mastercycler

Programa: SeqNA

Ciclo	Temperatura/tempo
25X	96ºC/10seg  + 50ºC/15seg + 60ºC/4min
1X	4ºC/∞

Armazenar em freezer -20ºC até a precipitação.

4. Precipitação com isopropanol

Material

-  Isopropanol 65%

-  Álcool 70%

-  Papel alumínio

-  Lenço de papel

-  Tubos estéreis

-  Banho Maria

1.      adicionar ao produto de PCR, 60µL de isopropanol 65%

2.      agitar em vortex por 10 segundos

3.      aguardar 30 minutos à TºC ambiente (±24ºC) protegido de luz

4.      centrifugar por 45 minutos em rotação Max (14.000rpm)

5.      remover o sobrenadante, virando o tubo por completo - tendo cuidado para não retornar o líquido ao tubo, deixar secar sobre o lenço de papel, ou pode ser removido com uma micropipeta.

6.      adicionar 100µL de álcool  70%

7.      agitar em vortex por 10 segundos

8.      centrifugar 15 minutos a 14.000rpm

9.      remover o sobrenadante da mesma forma que no item 5

10.  adicionar 100µL de álcool 70%

11.  agitar em vortex por 10 segundos

12.  centrifugar 10 minutos a 14.000rpm

13.  remover completamente o sobrenadante

14.  secar em banho à 60ºC por 15 minutos (deixar os tubos com a tampa aberta mas protegido da luz).

15.  armazenar a -20ºC por 15 à 20 dias no máximo.

5. Ressupender o produto em formamida HI

Reagente: Formamida HI

Código:

Marca: Applied Biosystems

Lot:

Validade:

o   Adicionar 10 à 15µL de formamida HI em cada poço ou tubo

o   Levar para Gilberto (Endócrino) devidamente identificada (nome, data, seu celular na placa)

o   Desnaturar à 95ºC por 5 minutos

o   Deixar em banho de gelo

o   Pronto para inserir no Sequenciador

6. Sequenciamento de DNA

6.1 Reação de PCR

·       Verificar quantas amostras serão amplificadas.

·       Fazer cálculos e diluição com H₂O para que cada amostra de DNA fique com a [ ] de 100ng / 8μl.

·       Com base na quantidade de amostras que serão amplificadas, fazer cálculo para o mix.

·       Em seguida distribuir o mix com os DNAs em eppendorfs devidamente identificados

Reagente	[ ] inicial	Volume (μl) 1X
H2O		64
Buffer	10X	10
MgCl2	50mM	4
dNTP	12,5mM	1,6
Primer SH (F)	10p moles/ μl	6
Primer NA2 (R)	10p moles/ μl	6
Taq platinum	5U/μl	0,4
DNA	100ng / 8μl	8
		100 μl

·      Levar as amostras a serem amplificadas para o termociclador, programado com a seguinte ciclagem:

1 ciclo - 95°C – 5 min.

35 ciclos – 95°C – 1min. / 59°C – 1min. / 72°C – 40 seg.

1 ciclo - 72°C – 10 min.

1 ciclo  - 4°C – 1h

Após o término, dar um spin nas amostras e purificá-las.

6.2 Purificação de DNA de solução

Kit: GFX  PCR  DNA e gel band purification kit

Código: 27.9602.01

Marca: GE Healthcare

** volume máximo de produto de PCR é de 100µL

1.         Acoplar a coluna de GFX em tubo que acompanha o kit. Utilizar 1 coluna para cada amostra.

2.         Identificar tubo e a coluna

3.         Add-se 500 µL de Capture Buffer na coluna GFX (se o seu produto de PCR tem 100µL, caso contrário fazer a regra de 3).

4.         Em seguida, adiciona-se 100 µL do produto de PCR e homogeniza-se de 4 a 6 vezes com a própria ponteira, tomando cuidado para a ponteira não tocar nas fibras da coluna.

5.         Centrifugar 30 segundos em rotação máxima

6.         Desprezar a solução decantada e recolocar a coluna no tubo

7.     Add-se 500 µL de Wash buffer (WB) previamente diluído em etanol absoluto (* preparar antes ao uso)

Exemplo: Para 10 amostras deve preparar 5000µL de WB de trabalho.

Porque: 10 amostras x 500 µL WB  = 5000 µL.

Como preparar: 1000 µL WB conc + 4000 µL de etanol absoluto = 5000 µL WB

* Se o kit for consumido dentro de 30 dias, pode preparar todo WB com etanol conforme a bula, caso contrário é melhor preparar na hora do uso. Por isso a identificação na tampa do frasco é importante (etanol: sim ou não)

8.         Centrifugar 30 segundos, rotação máxima

9.         Transferir a coluna GFX para tubo eppendorf  estéril, livre de DNase e RNase e com tampa, devidamente identifico.

10.      Aplicar 50µL de buffer eluição ou água ultra pura autoclavado, no centro da fibra de vidro da coluna sem tocar a ponteira na fibra.

11.      Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto

12.      Centrifugar 1 minuto a alta rotação

13.      Armazenar o produto purificado em freezer -20ºC.

6.3 Quantificação do DNA purificado em gel

1.         Preparar o gel de agarose 1,5 a 2,0%

2.         Preparar amostra

- misturar 4µL de produto purificado + 1µL de azul de bromofenol

3.         Preparar marcador (low mass ladder – Invitrogen)

- misturar 4µL de low mass ladder + 1µL de azul de bromofenol

4.         Aplicar 5 µL de amostra e marcador

5.         Aguardar corrida

6.         Fazer leitura no transluminador seguindo o protocolo do low mass ladder

7.         Registrar concentração.

6.4 Reação de Sequenciamento

Kit: Big Dye V 3.1

Código:

Marca: Applied Biosystems

A) Reação

Preparar na cuba de gelo

Reagente	Concentração	Quantidade por amostra	Reação para ___amostras
Buffer 5X	1X	4,0 µL
Pirmer F ou R	3,3 pmol/µL	1,0 µL
Produto de PCR purif.	30 ng (+ ou -)	2 µL
Big Dye		1,5 µL
H2O		11,5 µL
Total		20µL

Após adicionar Big-Dye, trabalhar sempre protegido da luz (envolver a placa em papel alumínio).

B) Condição para amplificação

Termociclador: Eppendorf  Mastercycler

Programa: SeqNA

Ciclo	Temperatura/tempo
25X	96ºC/10seg  + 50ºC/15seg + 60ºC/4min
1X	4ºC/∞

Armazenar em freezer -20ºC até a precipitação.

7. Precipitação com isopropanol

Material

ü   Isopropanol 65%

ü   Álcool 70%

ü   Papel alumínio

ü   Lenço de papel

ü   Tubos estéreis

ü   Banho Maria

1.         Adicionar ao produto de PCR, 60µL de isopropanol 65%

2.         Agitar em vortex por 10 segundos

3.         Aguardar 30 minutos à TºC ambiente (±24ºC) protegido de luz

4.         Centrifugar por 45 minutos em rotação Max (14.000rpm)

5.         Remover o sobrenadante, virando o tubo por completo - tendo cuidado para não retornar o líquido ao tubo, deixar secar sobre o lenço de papel, ou pode ser removido com uma micropipeta.

6.         Adicionar 100µL de álcool  70%

7.         Agitar em vortex por 10 segundos

8.         Centrifugar 15 minutos a 14.000rpm

9.         Remover o sobrenadante da mesma forma que no item 5

10.      Adicionar 100µL de álcool 70%

11.      Agitar em vortex por 10 segundos

12.      Centrifugar 10 minutos a 14.000rpm

13.      Remover completamente o sobrenadante

14.      Secar em banho à 60ºC por 15 minutos (deixar os tubos com a tampa aberta mas protegido da luz).

15.      Armazenar a -20ºC por 15 à 20 dias no máximo.

8. Ressupender o produto em formamida HI

Reagente: Formamida HI

Código:

Marca: Applied Biosystems

Lot:

Validade:

·      Adicionar 10 à 15µL de formamida HI em cada poço ou tubo

·      Levar para o departamento da Endócrino devidamente identificada (nome, data, seu celular na placa)

·      Desnaturar à 95ºC por 5 minutos

·      Deixar em banho de gelo

·      Pronto para inserir no Sequenciador

Para leitura do resultado
Programa: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

1-letter	3-letter	description
A	Ala	Alanine
R	Arg	Arginine
N	Asn	Asparagine
D	Asp	Aspartic acid
C	Cys	Cysteine
Q	Gln	Glutamine
E	Glu	Glutamic acid
G	Gly	Glycine
H	His	Histidine
I	Ile	Isoleucine
L	Leu	Leucine
K	Lys	Lysine
M	Met	Methionine
F	Phe	Phenylalanine
P	Pro	Proline
S	Ser	Serine
T	Thr	Threonine
W	Trp	Tryptophan
Y	Tyr	Tyrosine
V	Val	Valine
B	Asx	Aspartic acid or Asparagine
Z	Glx	Glutamine or Glutamic acid
X	Xaa	Any amino acid

---

Nucleic acid codes

code	description
A	Adenine
C	Cytosine
G	Guanine
T	Thymine
U	Uracil
R	Purine (A or G)
Y	Pyrimidine (C, T, or U)
M	C or A
K	T, U, or G
W	T, U, or A
S	C or G
B	C, T, U, or G (not A)
D	A, T, U, or G (not C)
H	A, T, U, or C (not G)
V	A, C, or G (not T, not U)
N	Any base (A, C, G, T, or U)